Facteurs pathogéniques

• Annotation fonctionnelle du génome

• Mise au point d’outils moléculaires pour le développement de la génomique fonctionnelle

En collaboration avec le Dr. Christopher Thornton de l’université d’Exeter (Royaume-Uni) et le Dr. Thomas Guillemette de l’équipe FungiSem de l’IRHS d’Angers, un protocole d'obtention de protoplastes a été mis au point au cours de ces derniers mois, ainsi qu'une méthode de transformation et d’invalidation de gènes à l’aide du gène de résistance à l’hygromycine B.

Néanmoins, la complémentation fonctionnelle comme la préparation de mutants multiples nécessitera la recherche de marqueurs de sélection supplémentaires, qui viendront complétés le panel existant. Parallèlement, des systèmes d'expression seront développés afin d’évaluer l’impact de la surexpression d’un gène.

• Voie de synthèse de la mélanine

Outre la protection des cellules fongiques contre les UV ou l'élévation de la température, la mélanine est aussi connue pour assurer la rigidité de la paroi, fixer les métaux ou encore stocker l’eau et des ions afin de prévenir de la dessication. Elle joue par ailleurs un rôle important dans la pathogénicité, en protégeant les champignons des peptides antimicrobiens et des antifongiques, et en masquant les polysaccahrides de paroi et ainsi en empéchant leur reconnaisance par les PRP. Ainsi, l’inhibition de la synthèse de la mélanine est associée à la perte du pouvoir pathogène chez Sporothrix schenkii ou encore A. fumigatus. Chez ce dernier, la dihydroxynaphtalène (DHN)-mélanine joue aussi un rôle indirect dans la pathogénicité en participant à l’assemblage des différents composants de la paroi des spores et à l’expression en surface des molécules impliquées dans l’adhérence et des hydrophobines.

En outre, l'invalidation du gène ALB1 codant la polykétide synthase se traduit par une perte de la virulence et une sensibilité accrue aux systèmes de défense de l'hôte, notamment les radicaux oxygénés, alors que des résultats contradictoires ont été rapportés pour l'invalidation de gènes codant les enzymes impliquées dans les étapes plus tardives de cette voie de biosynthèse.

Chez S. boydii, la synthèse de la mélanine s'effectue essentiellement, sinon exclusivement par la voie du dihydroxynaphtalène (DHN-mélanine), voie métabolique complexe qui implique chez A. fumigatus six gènes organisés en cluster. L'analyse bioinformatique du génome de S. apiospermum a permis d’identifier le cluster correspondant. Les différents gènes seront donc inactivés et la caractérisation phénotypique des mutants sera entreprise.

Voie de synthèse de la mélanine chez A. fumigatus et organisation des gènes impliqués.

• Enzymes du stress oxydant

Dans ce domaine, nous avons purifié et caractérisé chez S. boydii deux des enzymes impliquées dans la dégradation des radicaux oxygénés produits par les cellules phagocytaires, une superoxyde dismutase cytosolique et une catalase monofonctionnelle, et séquencé les gènes correspondants. Par ailleurs, des protéines recombinantes ont été produites dont nous avons montré l'intérêt dans le sérodiagnostic des scédosporioses.

La caractérisation des enzymes du stress oxydant est poursuivie dans le cadre de la thèse de Cindy Staerck. Une analyse bioinformatique a en effet montré la présence dans le génome de S. apiospermum de 7 gènes codant des superoxyde dismutases, 3 codant des catalases, 7 des peroxydases, 6 des thiorédoxines/glutarédoxines, et 5 des nitrate et nitrite réductases. L'expression de ces gènes est évaluée en condition de stress oxidant ainsi que dans des sytèmes de co-culture cellules phagocytaires/tubes germinatifs de S. apiospermum. Les meilleurs candidats seront invalidés, et les répercussions de ces mutations sur la pathogénicité seront précisées.

• Voie de signalisation de l'AMP cyclique

Chez les eucaryotes, la cascade de signalisation de l'AMP cyclique (AMPc) est retrouvée aussi bien chez l'homme que chez les champignons pathogènes. Un stimulus externe, le plus souvent relayé par un récepteur couplé à une protéine G, active l'adénylate cyclase qui à son tour active la protéine kinase A en synthétisant l'AMPc. L'activation de l'adénylate cyclase par l'anhydrase carbonique via la synthèse d'ions bicarbonates semble plus spécifique aux champignons.

Des travaux préliminaires montrent que l'exposition des cultures de S. apiospermum à une atmosphère enrichie en dioxyde de carbone, comme l’addition de bicarbonate ou d'un agoniste de l'adénylate cyclase dans le milieu de culture, stimule la croissance hyphale et augmente le taux de germination des spores. Ces résultats confirment que, de façon identique à d’autres espèces fongiques pathogènes la pression partielle en CO₂ (ppCO₂) régule la morphogénèse chez S. apiospermum, vraisemblablementvia la voie AMPc.

Nous étudions donc actuellement la cascade de signalisation activée par l'augmentation de la ppCO₂ chez S. apiospermum, afin de caractériser les mécanismes moléculaires régulant, via cette cascade de signalisation, la morphogénèse chez ce champignon et de déterminer son éventuelle implication dans la faible sensibilité intrinsèque de ce champignon aux antifongiques.

L'analyse bioinformatique a permis d'identifier dans le génome de S. apiospermum les différents gènes potentiellement impliqués dans la réponse au CO₂, codant l'anhydrase carbonique, la phosphodiestérase qui permet le recyclage de l'AMPc et assure ainsi une activation transitoire de la voie, les sous-unités catalytiques et régulatrices de la protéine kinase A, le facteur de transcription Efg1 cible de la protéine kinase A, et un orthologue du facteur de transcription Rca1 qui régule chez C. albicans l'expression de l'anhydrase carbonique. Ces gènes d’intérêt seront inactivés par délétion et le phénotype des mutants ainsi obtenus sera déterminé.

Voie de signalisation de l'AMPc.

• Histidine kinases et voies de signalisation cellulaire associées

Les voies de signalisation histidine-aspartate kinases sont utilisées par les bactéries, les plantes et les champignons pour percevoir une large palette de signaux environnementaux et proposer une réponse adaptée. Si les schémas de phosphorylations successives impliqués dans ces voies sont assez simples chez les procaryotes, ils sont généralement plus complexes chez les plantes et les champignons pathogènes : ils sont alors nommés relais multiples de phosphorylation.

Des travaux récents ont porté sur l’implication des systèmes histidine-aspartate kinases dans la morphogenèse et la virulence chez différents pathogènes fongiques. Il est à présent admis que les premiers acteurs de ces voies, à savoir les histidine kinases (HK), sont des facteurs de virulence chez C. albicans, Cryptococcus neoformans et les champignons dimorphiques.

Une première analyse bioinformatique du génome de S. apiospermum montre que ce champignon possède six gènes distincts codant potentiellement des HK. La fonction de ces gènes est actuellement abordée dans le cadre de la thèse d’Anaïs Hérivaux.

Schéma théorique montrant l’organisation canonique des systèmes histidine aspartate kinases chez les champignons.

• Approches de génomique comparative

Scedosporium apiospermum est aujourd'hui considéré comme un complexe de cinq espèces morphologiquement indifférenciables, dont quatre seulement sont connues dans la mucoviscidose.

Le complexe S. apiospermum comprend en effet une cinquième espèce appelée Scedosporium dehoogii qui est abondante dans l'environnement et tout aussi virulente dans un modèle expérimental de souris immunodéprimées, mais curieusement très rare en pathologie humaine

Dans cette étude menée en colaboration avec les équipes EcoFun (Dr. Bruno Le Cam) et BioInfo (Dr. Jean-Pierre Renou) de l'IRHS (Angers), le génome des espèces pathogènes du complexe S. apiospermum sera donc comparé à celui de S. dehoogii. Pour s'affranchir du polymorphisme existant chez toute espèce vivante, le génome de cinq souches de chaque espèce sera séquencé et une analyse bioinformatique de génomique comparative sera réalisée au sein du complexe. De ce projet de recherche est attendue l'identification de gènes potentiellement impliqués dans la pathogénicité de S. apiospermum.